ДЕЙСТВИЕ АУТОПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА СОСТОЯНИЕ МЕСТНОГО ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VIVO
УДК 579.61
ДЕЙСТВИЕ АУТОПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА СОСТОЯНИЕ МЕСТНОГО ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VIVO
О.П. Панасовец, к.б.н., старший научный сотрудник
ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора
(344000, г. Ростов-на-Дону, пер. Газетный, 119/262/157)
E-mail: gggud@yandex.ru
Е.А. Иванова, младший научный сотрудник
ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора
(344000, г. Ростов-на-Дону, пер. Газетный, 119/262/157)
E-mail: lenushka345@mail.ru
М.Н. Гапон, к.б.н., ведущий научный сотрудник
ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора
(344000, г. Ростов-на-Дону, пер. Газетный, 119/262/157)
E-mail: marina.gapon@mail.ru
Аннотация. Взвеси 15 аутоштаммов лактобактерий (Lb), выделенных из биотопов толстой кишки 30 женщин фертильного возраста, использовали для пероральной санации лабораторных мышей с дисбиозом толстой кишки. Оценка состояния местного цитокинового статуса в копрофильтратах до приема Lb выявила превышение допустимого уровня γ-ИФН во всех группах животных. Несмотря на то, что в большинстве случаев содержание цитокинов до и после приема лактобактерий находилось в пределах референтных значений, все использованные аутоштаммы Lb оказали положительное влияние на выработку большинства ключевых про- и противовосполительных цитокинов на местном уровне. Результаты исследования подтвердили перспективность перорального использования аутоштаммов Lb для коррекции местного цитокинового дисбаланса.
Ключевые слова: аутоштаммы лактобактерий, цитокины, копрофильтраты мышей, местный цитокиновый статус, дисбиоз.
Введение. Ухудшение экологической обстановки, стрессы и нарушение питания часто приводят к нарушению баланса микробиоты в толстой кишке. В целях поддержания здоровья населения и повышения продолжительности жизни крайне важной задачей является разработка и внедрение в лечебную практику рациональных патогенетически обоснованных схем коррекции и профилактики дисбиозов. Наиболее физиологичным способом восстановления здорового баланса микробиоценоза считаются препараты, способные восполнять дефицит индигенных бактерий и стимулировать размножение уже имеющихся в кишечнике собственных эубионтов [2-5].
Перспективным подходом в персонализированной медицине для коррекции микробиоценоза является использование аутопробиотиков, подразумевающее использование собственных микроорганизмов пациента, особенно в случаях, когда стандартные пробиотики неэффективны или требуется максимально точное восстановление индивидуальной микробиоты [2, 3]. Корректирующий эффект аутопробиотикотерапии на основе лактобактерий при микроэкологических нарушениях определяется двумя ключевыми механизмами: прочной адгезией к слизистой и подавлением роста патогенных микроорганизмов. Важное преимущество метода – отсутствие негативного воздействия на эпителиальный слой и сохранение защитного слизистого барьера кишечника. Особого внимания заслуживает их иммуностимулирующая активность. Неразрывное взаимодействие между кишечной микробиотой и иммунными компонентами, регулируемое цитокинами, лежит в основе формирования и поддержания гомеостаза кишечного биотопа. Изменения в продукции провоспалительных цитокинов иммуноцитами служат маркером метаболических процессов и развития воспалительно-деструктивных изменений в толстой кишке [4]. Физиологический уровень цитокинов у здоровых лиц обеспечивает стабильный иммунный ответ, тогда как дисбиоз вызывает дисбаланс их содержания. Пробиотики оказывают иммуномодулирующее действие: корректируют соотношение популяций лимфоцитов и стимулируют выработку цитокинов, определяющих тип поляризации иммунного ответа и способствующих восстановлению гомеостаза [4-8]. На сегодняшний день отсутствуют унифицированные критерии для сравнительной оценки иммуномодулирующих эффектов пробиотических бактерий. Таким образом, изучение вариации уровня цитокинов в копрофильтратах у модельных животных после введения исследуемых штаммов лактобактерий может служить объективным маркером для оценки перспективности их применения в аутопробиотикотерапии.
Цель исследования: оценить влияние штаммов лактобактерий на уровень про- и противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах модельных животных и определить их значимость как предикторов эффективности коррекции микробного дисбаланса.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили копрофильтраты половозрелых мышей до и после 24 дневного выпаивания взвесью (10 МЕ) штаммов лактобактерий (L.рlantarum-1, L.crispatus-2, L.paracasei-4, L.paracasei-5, L.rhamnosus-6, L.gasseri-7, L.plantarum-8, L.gasseri-9, L.sakei-11, L.sakei-12, L.sakei-13, L.rhamnosus-14, L.paracasei-15, L.plantarum-1Б, L.gonsoni-2Б), выделенных от 30 беременных и небеременных женщин фертильного возраста. Культуры лактобактерий, изолированные из содержимого толстой кишки женщин, хранились на среде МРС при температуре +4оС. Перед экспериментом бактериальную массу каждой культуры разводили по стандарту мутности на 10 МЕ в стерильном физиологическом растворе. В эксперименте было задействовано количество групп животных, конгруэнтное числу штаммов лактобактерий (n=15). Мыши содержались в клетках по 6 штук с одинаковым рационом питания и свободным доступом к воде. Ежедневно, на протяжении 24 суток, каждая мышь получала перорально по 0,1 мл (2 капли) взвеси лактобактерий, что в пересчете на вес животного соответствует 15 дозам (по 5 доз 3 раза в сутки), рекомендуемым для приема людям. В каждой группе еженедельно осуществляли пуловый сбор содержимого толстой кишки мышей с последующим проведением бактериологического анализа.
Работа с животными проводилась в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС международной Конвенции об охране животных, используемых в научных целях, а также согласно ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», на основании Протокола Локального этического комитета при ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора от 2025 года. В ходе эксперимента боль животным не причинялась. При выпаивании взвесями аутопробиотических лактобактерий ни одна особь не погибла. Клинических признаков заболеваний у мышей не выявлялось.
Идентификацию видов изолированных культур лактобактерий определяли методом масс-спектрометрии MALDI-TOF (Bruker). Уровень про- и противовоспалительных цитокинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-α (фактор некроза опухоли), ИФН-ɤ в копрофильтратах определяли методом ИФА в соответствии с ранее разработанной нами методикой [1].
Результаты исследования. С учётом значимости цитокинового баланса для поддержания колонизационной резистентности кишечника был проведён анализ цитокинового статуса в копрофильтратах экспериментальных мышей до и после пероральной санации с использованием взвесей 15 аутоштаммов. Выявленные изменения уровней цитокинов представлены в таблице.
Таблица
Показатели цитокинов в копрофильтратах мышей
до и после 21-дневной пероральной санации аутоштаммами лактобактерий
|
№ штамма Lb |
ИЛ-1β 0-11 пг/мл |
ИЛ-2 0-10 пг/мл |
ИЛ-4 0-4 пг/мл |
ИЛ-6 0-10 пг/мл |
ИЛ-8 0-12 пг/мл |
ИЛ-10 0-20 пг/мл |
ФНО-α 0-8 пг/мл |
ИФН-ɤ 0-10 пг/мл |
||||||||
|
до |
после |
до |
после |
до |
после |
до |
после |
до |
после |
до |
после |
до |
после |
до |
после |
|
|
1 |
55 |
3,3+ |
42 |
4 + |
6,2 |
7,3 - |
1,4 |
3 - |
0,9 |
0,5+ |
2,7 |
4 + |
4 |
5 - |
15 |
1,3+ |
|
2 |
48 |
2,5+ |
5 |
1,6+ |
12 |
7,3+ |
2,3 |
2,1+ |
1 |
1 + |
2,3 |
3,1+ |
3 |
4- |
10 |
1,3+ |
|
4 |
46 |
6,5+ |
5 |
5 + |
11 |
6,0+ |
2 |
1,9+ |
1 |
2 - |
3,6 |
6,3+ |
4,5 |
4,9- |
13 |
1+ |
|
5 |
70 |
6,8+ |
6 |
5 + |
10 |
9 + |
2,2 |
1,9+ |
1 |
1,5 - |
3,8 |
3,9+ |
4,8 |
10- |
12 |
1,3+ |
|
6 |
73 |
6,6+ |
5 |
1,8+ |
10,5 |
7 + |
2 |
3,5- |
1,4 |
1,6 - |
4,2 |
5,8+ |
3,8 |
8 - |
15 |
1,4+ |
|
7 |
63 |
6,6+ |
5,8 |
2 + |
6,4 |
6, 5- |
2,1 |
2,6 - |
1 |
1,5 - |
4,6 |
4,6+ |
4,8 |
5 - |
19 |
1,2+ |
|
8 |
56 |
2 + |
5,5 |
1+ |
13 |
6,4+ |
1 |
1,8 - |
1 |
1,4- |
3,2 |
5,1+ |
3,5 |
4,7 - |
19 |
1,2+ |
|
9 |
57 |
4 + |
5,9 |
2+ |
11,8 |
6,2+ |
1,8 |
2 - |
0,8 |
1,5- |
3,2 |
3,5+ |
2,7 |
13 - |
18 |
0,7+ |
|
11 |
26 |
1,8+ |
6 |
1,6+ |
7,5 |
13,5 - |
1,6 |
2 - |
1 |
0,5+ |
2,9 |
2,9+ |
5 |
6 - |
14 |
1,2+ |
|
12 |
23 |
1,7+ |
2 |
1,1+ |
77 |
8,5 + |
1,3 |
1,6 - |
1,4 |
0,7+ |
3,4 |
2,8 - |
4 |
4,7 - |
13 |
1,3+ |
|
13 |
21 |
4,1+ |
9 |
6 + |
10 |
6,4+ |
1,7 |
2,5 - |
1,4 |
1 + |
3,6 |
3,7+ |
5,5 |
5 + |
14 |
2+ |
|
14 |
12 |
1,5+ |
5,5 |
2+ |
11,8 |
6,2+ |
1,9 |
1,8 - |
1,4 |
1 + |
3,9 |
3,3- |
5,4 |
4 + |
25 |
1,2+ |
|
15 |
20 |
6,7+ |
6 |
2+ |
12,2 |
12,3- |
1,6 |
1,6+ |
1,4 |
1 + |
3,8 |
3,4 - |
4,7 |
3,8+ |
20 |
1,3+ |
|
1-б |
18 |
1,4+ |
7 |
1,5+ |
9 |
11,3 - |
2,1 |
1,5+ |
1,5 |
1 + |
3,8 |
3,9+ |
4,2 |
4,6 - |
10 |
1,3+ |
|
2-б |
22 |
1,3+ |
5,5 |
2+ |
12,5 |
11,2 + |
1,5 |
1,2+ |
1,4 |
1 + |
3,4 |
3,5+ |
4,7 |
4,9- |
10 |
2+ |
Примечание: (+)/(-) - обозначают положительную и отрицательную тенденцию в динамике изменения уровня цитокинов после санации
Несмотря на разнонаправленность выявленных изменений, полученные данные свидетельствуют о благоприятном воздействии всех, используемых для санации аутоштаммов на состояние местного цитокинового статуса животных. В большинстве случаев содержание цитокинов до и после приема лактобактерий находилось в пределах референтных значений. Исключение во всех вариантах составили провоспалительные цитокины ИЛ-1β, а в одном случае (при использовании штамма L.рlantarum-1) и ИЛ-2, количество которых до коррекции значительно превышало контрольные значения. Повышенное содержание провоспалительного ФНО-α было выявлено лишь в двух группах мышей, принимавших штаммы L.paracasei-5 и L.gasseri-9 Сравнительный анализ величин противовоспалительного ИЛ-4 показал, что его исходный и конечный уровни у всех мышей превышал допустимые значения. Тем не менее, пероральная санация оказала благоприятное воздействие в 62,5% случаев, когда у животных фиксировалось снижение уровня ИЛ-4. Выявленная тенденция коррелирует с ослаблением экспрессии провоспалительных маркеров и позволяет предположить формирование более сбалансированного иммунного ответа на местном уровне, что согласуется с данными, полученными другими исследователями [7]. В тоже время первопричина повышенной продукции ИЛ-4, будь то конституциональные особенности иммунной системы используемых мышей или наличие у них субклинических воспалительных процессов, подлежит уточнению в рамках последующих исследований. Несмотря на то, что уровень противовоспалительного ИЛ-10 до санации находился в диапазоне допустимых значений, в большинстве (86,6%) случаев после санации наблюдались исключительно положительные изменения. Ранее в наших работах было установлено, что уровень γ-ИФН в копрофильтратах является важным критерием, коррелирующим с изменениями в микробиоме толстой кишки [1]. В настоящем исследовании данный показатель наряду с другими про- и противовоспалительными цитокинами, свидетельствует об улучшении состояния цитокинового статуса на местном уровне после перорального использования взвесей разных видов лактобактерий. При этом выявленные особенности (повышенный уровень ИЛ-4 и отдельные случаи роста провоспалительных цитокинов) требуют дальнейшего изучения для выяснения механизмов воздействия аутоштаммов.
Заключение. Несмотря на разнонаправленность изменений отдельных показателей, все использованные аутоштаммы оказали положительное влияние на местный цитокиновый статус животных. Это подтверждается динамикой ключевых про- и противовоспалительных цитокинов. Пероральная санация аутоштаммами лактобактерий способствует нормализации местного цитокинового баланса у экспериментальных животных, снижая выраженность провоспалительных реакций и поддерживая противовоспалительные механизмы. Полученные данные подтверждают перспективность использования изучаемых аутоштаммов для коррекции цитокинового статуса и поддержания колонизационной резистентности кишечника.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гапон, М.Н., Терновская, Л.Н., Твердохлебова, Т.И. Комплексный подход к совершенствованию диагностики и коррекции нарушений микробной экологии толстой кишки. – Ростов-на-Дону: Изд-во Мини Тайп, 2022. – 230 с.
2. Кайбышева, В.О., Никонов, Е.Л. Пробиотики с позиции доказательной медицины. Доказательная гастроэнтерология. – 2019;8(3):45-54. DOI: 10.17116/dokgastro2019803145.
3. Котенко, К.В., Еремин, И.И., Округина, С.А., и др. Виды микроорганизмов из состава индивидуальной микрофлоры человека для получения аутологичного пробиотика с целью применения в программах реабилитации хирургических больных. Доказательная гастроэнтерология. – 2022;11(4):77-79. DOI: 10.17116/dokgastro20221104177.
4. Красновидова, А.Е., Семикина, Е.Л., Дроздова, А.С., Потапов, А.С. Местная иммунная реакция при воспалительных заболеваниях кишечника. Вопросы практической педиатрии. – 2025; 20(1): 76–82. DOI: 10.20953/1817-7646-2025-1-76-82.
5. Мурашкина, И.А., Мирович, В.М., Маркеев, А.А. Характеристика нормофлоры, производство лекарственных средств и их применение в медицине: учебное пособие. – Иркутск: Изв-во ИГМУ, 2023. – 99 с.
6. Сташкевич, Д.С., Филлипова, Ю.Ю., Бурмистрова, А.Л. Актуальные вопросы иммунологии: система цитокинов, биологическое значение, генетический полиморфизм, методы определения: учебное пособие. – Челябинск: Изд-во Челябинского гос. ун-та, 2020. – 102 с. ISBN 978-5-7271-1633-3.
7. Топол, И.А., Полякова, И.С., Елыкова, А.В. Роль кишечной микробиоты в регуляции иммунных реакций в иммунной системе кишечника в условиях стресса и при модуляции её состава путём введения антибиотиков и пробиотиков. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2022;99(6):722–733. DOI: 10.36233/0372-9311-270.
8. Хавкин, А.И., Ситкин, С.И. Влияние таргетных пробиотиков на ось «микробиота – кишечник – иммунная система». Вопросы практической педиатрии. – 2023; 18(6): 107–118. DOI: 10.20953/1817-7646-2023-6-107-118.
REFERENCES
1. Gapon M.N., Ternovskaya L.N., Tverdohlebova T.I. Kompleksnyj podhod k sovershenstvovaniyu diagnostiki i korrekcii narushenij mikrobnoj ekologii tolstoj kishki [A comprehensive approach to improving the diagnosis and correction of disorders of the microbial ecology of the colon]. Rostov-na-Donu: Izd-vo Mini Tajp, 2022. 230 p. (In Russ.).
2. Kajbysheva V.O., Nikonov E.L. Probiotiki s pozicii dokazatel'noj mediciny [Probiotics from the standpoint of evidence-based medicine]. Dokazatel'naya gastroenterologiya [Evidence-based gastroenterology]. 2019;8(3):45-54. DOI: 10.17116/dokgastro2019803145. (In Russ.).
3. Kotenko K.V., Eremin I.I., Okrugina S.A., i dr. Vidy mikroorganizmov iz sostava individual'noj mikroflory cheloveka dlya polucheniya autologichnogo probiotika s cel'yu primeneniya v programmah reabilitacii hirurgicheskih bol'nyh [Types of microorganisms from the composition of individual human microflora for obtaining an autologous probiotic for use in rehabilitation programs for surgical patients]. Dokazatel'naya gastroenterologiya [Evidence-based gastroenterology]. 2022;11(4):77-79. DOI: 10.17116/dokgastro20221104177. (In Russ.).
4. Krasnovidova A.E., Semikina E.L., Drozdova A.S., Potapov A.S. Mestnaya immunnaya reakciya pri vospalitel'nyh zabolevaniyah kishechnika [Local immune reaction in inflammatory bowel disease]. Voprosy prakticheskoj pediatrii [Questions of practical pediatrics]. 2025; 20(1): 76–82. DOI: 10.20953/1817-7646-2025-1-76-82. (In Russ.).
5. Murashkina I.A., Mirovich V.M., Markeev A.A. Harakteristika normoflory, proizvodstvo lekarstvennyh sredstv i ih primenenie v medicine: uchebnoe posobie [Characteristics of normoflora, production of medicinal products and their use in medicine: textbook]. Irkutsk: Izv-vo IGMU, 2023. 99 p. (In Russ.).
6. Stashkevich D.S., Fillipova YU.YU., Burmistrova A.L. Aktual'nye voprosy immunologii: sistema citokinov, biologicheskoe znachenie, geneticheskij polimorfizm, metody opredeleniya: uchebnoe posobie [Current immunology issues: cytokine system, biological significance, genetic polymorphism, methods of determination: textbook]. CHelyabinsk: Izd-vo CHelyabinskogo gos. un-ta, 2020. 102 p. ISBN 978-5-7271-1633-3. (In Russ.).
7. Topol I.A., Polyakova I.S., Elykova A.V. Rol' kishechnoj mikrobioty v regulyacii immunnyh reakcij v immunnoj sisteme kishechnika v usloviyah stressa i pri modulyacii eyo sostava putyom vvedeniya antibiotikov i probiotikov [The role of the intestinal microbiota in regulating immune responses in the intestinal immune system under stress and in modulating its composition by administering antibiotics and probiotics]. ZHurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2022;99(6):722–733. DOI: 10.36233/0372-9311-270. (In Russ.).
8. Havkin A.I., Sitkin S.I. Vliyanie targetnyh probiotikov na os' «mikrobiota – kishechnik – immunnaya sistema» [Effect of targeted probiotics on the microbiota-gut-immune system axis]. Voprosy prakticheskoj pediatrii [Questions of practical pediatrics]. 2023; 18(6): 107–118. DOI: 10.20953/1817-7646-2023-6-107-118. (In Russ.).
Материал поступил в редакцию 27.02.26
THE EFFECT OF AUTOPROBIOTIC LACTOBACILLI STRAINS ON THE LOCAL
CYTOKINE STATUS IN AN IN VIVO EXPERIMENT
O.P. Panasovets, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher
Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology
(344000, Rostov-on-Don, Gazetny,119/262/157)
E-mail: gggud@yandex.ru
E.A. Ivanova, Junior research assistant
Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology
(344000, Rostov-on-Don, Gazetny,119/262/157)
E-mail: lenushka345@mail.ru
M.N. Gapon, Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher
Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology
(344000, Rostov-on-Don, Gazetny,119/262/157)
E-mail: marina.gapon@mail.ru
Abstract. Suspensions of 15 lactobacilli (Lb) autostrains isolated from the colonic biotopes of 30 fertile women were used for oral sanitization of laboratory mice with colonic dysbiosis. Assessment of local cytokine status in coprofiltrates before Lb administration revealed elevated γ-IFN levels in all animal groups. Although cytokine levels before and after lactobacilli administration were within reference limits in most cases, all Lb autostrains used had a positive effect on the production of most key pro- and anti-inflammatory cytokines locally. The study results confirmed the potential of oral administration of Lb autostrains for correcting local cytokine imbalances.
Keywords: lactobacilli autostrains, cytokines, mouse coprofiltrates, local cytokine status, dysbiosis.