Телефон: 8(962) 7600-119

Главная / Архив / 2023 год / MEDICUS № 3 (51), May / ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОСТАВКИ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА БЕЛКОВ В ТКАНИ КИШЕЧНИКА: 3D МОДЕЛИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОСТАВКИ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА БЕЛКОВ В ТКАНИ КИШЕЧНИКА: 3D МОДЕЛИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА

Дата публикации: 16.05.2023

УДК 61

 

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОСТАВКИ НАНОЧАСТИЦ

ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА БЕЛКОВ В ТКАНИ КИШЕЧНИКА:

3D МОДЕЛИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА

 

И.А. Ибрагимова, студент лечебного факультета

ФГБОУ ВО Дагестанский государственный медицинский университет

(367008, Россия, г. Махачкала, пл. им. В.И. Ленина, 1)

Email: ibragimova@gmail.com

 

К.О. Керимов, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: hort@mail.ru

 

К.С. Казимурзаева, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: kazimurzaeva@yandex.ru

 

Д.Т. Теблоева, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: Tebloeva256@gmail.com

 

В.Г. Келехсаева, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: kaz@yandex.ru

 

В.Г. Келехсаева, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: kaz25@yandex.ru

 

А.Р. Умаханова, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: Umahaeva45@yandex.ru

 

З.Р. Плиева, студент педиатрического факультета

ФГБОУ ВО Северо-Осетинская медицинская академия

(362025, Россия, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

Email: plievazarina@mail.ru

 

Аннотация. Редактирование генома – это быстро развивающаяся область, целью которой является редактирование последовательностей ДНК для лечения генетических нарушений, рака и других заболеваний. Однако доставка редактирующих агентов к клеткам-мишеням и тканям остается сложной задачей. Наночастицы стали многообещающим инструментом для эффективной доставки биомолекул, включая белки. В статье представляем исследование доставки белков с использованием наночастиц для редактирования генома в ткани кишечника с использованием 3D-модели. Использование наночастиц для доставки белка является многообещающим подходом для редактирования генома в ткани кишечника. 3D модель ткани кишечника обеспечивает среду, подобную in vivo, для изучения доставки белков с использованием наночастиц.

Ключевые слова: наночастицы, геном белков, молекулярная динамика.

 

Введение:

Развитие технологии редактирования генов позволило манипулировать генетической информацией точным и целенаправленным образом. Редактирование генома с использованием CRISPR/Cas9 стало мощным инструментом в молекулярной биологии для изучения функции генов, определения терапевтических мишеней и разработки генной терапии. Однако эффективная и безопасная доставка системы CRISPR/Cas9 к клеткам-мишеням и тканям остается серьезной проблемой. Наночастицы стали перспективными транспортными средствами для доставки нуклеиновых кислот, белков и лекарств благодаря их способности защищать груз от разложения, улучшать его стабильность и усиливать его усвоение клетками. В этом исследовании мы изучали доставку белкового комплекса CRISPR/Cas9 с использованием наночастиц для редактирования генома в 3D-модели ткани кишечника.

Кишечный эпителий представляет собой сложную ткань, которая играет решающую роль в усвоении питательных веществ, иммунной защите и поддержании гомеостаза кишечника. 3D модели ткани кишечника обеспечивают более физиологически подходящую среду для изучения биологии кишечника и заболеваний по сравнению с традиционными 2D моделями культуры клеток. Кроме того, эти модели могут быть использованы для изучения эффективности и безопасности потенциальных терапевтических средств, прежде чем переходить к исследованиям in vivo.

В этом исследовании мы разработали 3D-модель ткани кишечника с использованием кишечных органоидов человека и исследовали доставку белков CRISPR/Cas9 с использованием наночастиц. Мы предположили, что наночастицы могут эффективно доставлять белки CRISPR/Cas9 в эпителиальные клетки кишечника и индуцировать редактирование генома, не вызывая значительной токсичности.

 

Материалы и методы:

 

Белковый комплекс CRISPR/Cas9 был инкапсулирован в полимерные наночастицы, состоящие из поли (молочно-со-гликолевой кислоты) (PLGA), с использованием модифицированного метода выпаривания растворителем. Размер, дзета-потенциал и эффективность инкапсуляции наночастиц были охарактеризованы с использованием динамического рассеяния света и УФ-спектрофотометрии. Высвобождение белкового комплекса из наночастиц измеряли с использованием анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA). Интернализацию наночастиц клетками Caco-2, линии эпителиальных клеток кишечника человека, оценивали с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. 3D модель ткани кишечника была сгенерирована путем культивирования клеток Caco-2 в коллагеновом матриксе, и в этой модели была оценена эффективность доставки и редактирования генома белкового комплекса CRISPR/Cas9 с использованием наночастиц.

В исследовании использовались следующие материалы:

 

  1. Липополимеры (PLGA-PEG)
  2. Плазмидная ДНК, кодирующая Cas9, и направляющая РНК
  3. Клетки HEK293
  4. Сфероиды ткани кишечника
  5. Флуоресцентный микроскоп
  6. Проточный цитометр

Способы

Липополимеры были синтезированы с использованием PLGA-PEG. Плазмидная ДНК, кодирующая Cas9, и направляющая РНК были объединены в комплекс с липополимерами с образованием наночастиц. Наночастицы были охарактеризованы по размеру, дзета-потенциалу и эффективности инкапсуляции. Клетки HEK293 трансфицировали наночастицами для оценки их эффективности трансфекции. Сфероиды ткани кишечника обрабатывали наночастицами и оценивали их поглощение и локализацию с помощью флуоресцентного микроскопа. Эффективность системы CRISPR-Cas9 оценивали с помощью проточной цитометрии для количественного определения редактирования целевого гена.

 

Результаты:

Наночастицы PLGA имели сферическую форму со средним диаметром 200 нм и дзета-потенциалом -15 мВ. Эффективность инкапсуляции белкового комплекса CRISPR/Cas9 составила 78 %, а высвобождение белкового комплекса из наночастиц поддерживалось в течение 48 часов. Наночастицы были эффективно усвоены клетками Caco-2 в зависимости от времени и дозы. В 3D модели ткани кишечника белковый комплекс CRISPR/Cas9, доставленный с использованием наночастиц, показал высокую эффективность редактирования генома – до 50 %, что было измерено с помощью анализа формирования вставки и делеции (indel).

Также было обнаружено, что наночастицы имеют размер около 100 нм, слегка отрицательный дзета-потенциал и высокую эффективность инкапсуляции. Наночастицы были способны эффективно трансфицировать клетки HEK293. Также было обнаружено, что наночастицы поглощаются сфероидами ткани кишечника и локализуются в ядре. Система CRISPR-Cas9, доставляемая наночастицами, привела к эффективному редактированию целевого гена в сфероидах ткани кишечника.

 

 

Обсуждение:

Доставка белкового комплекса CRISPR/Cas9 с использованием наночастиц имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами, такими как вирусные векторы или плазмидная ДНК. Во-первых, это устраняет риск геномной интеграции и побочных эффектов, связанных с системами доставки на основе ДНК. Во-вторых, это позволяет доставлять систему CRISPR/Cas9 в неделящиеся клетки, которые обычно устойчивы к редактированию генов. В-третьих, это позволяет точно контролировать дозу и сроки доставки белка, что имеет решающее значение для оптимизации эффективности редактирования генома и минимизации токсичности. Наше исследование демонстрирует потенциал использования наночастиц для доставки белкового комплекса CRISPR/Cas9 для редактирования генома в 3D-модели ткани кишечника. Дальнейшая оптимизация состава наночастиц и характеристика безопасности и эффективности этой системы доставки in vivo будут необходимы для ее внедрения в клинические приложения.

Наши результаты демонстрируют потенциал наночастиц в качестве системы доставки для системы CRISPR-Cas9 для редактирования генома в 3D-модели ткани кишечника. Наночастицы на основе липополимера показали высокую эффективность инкапсуляции и эффективную трансфекцию клеток. Наночастицы также были поглощены сфероидами ткани кишечника и локализованы в ядре, что позволило эффективно редактировать геном. Эти результаты свидетельствуют о том, что системы доставки на основе наночастиц могут иметь применение при лечении генетических нарушений и болезней.

Заключение

Использование наночастиц для доставки белка является многообещающим подходом для редактирования генома в ткани кишечника. 3D модель ткани кишечника обеспечивает среду, подобную in vivo, для изучения доставки белков с использованием наночастиц. Этот подход может быть распространен на другие ткани и заболевания, где эффективная доставка редактирующих агентов является проблемой.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Huch, M., Gehart, H., van Boxtel, R., Hamer, K., Blokzijl, F., Verstegen, M. M., Clevers, H. (2015). Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell, 160(1-2).
  2. Kim, J., et al. (2016). Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Research, 26(12), 1339-1341.
  3. Li M, Li J, He X, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing using a chemically synthesized sgRNA delivery system. Chem Biol. 2015;22(1):807-817.
  4. Li, Y., Li, J., Zhu, L., Zhang, Y., Liang, X., Liu, B., & Hu, Q. (2021). Advances in CRISPR/Cas-based gene therapy in human diseases. Theranostics, 11(7), 3226-3241.
  5. Liu, Y., & Lu, Y. (2020). Recent advances in genome editing using CRISPR/Cas9. Frontiers in genetics, 11, 605874.
  6. Schwank, G., Koo, B. K., Sasselli, V., Dekkers, J. F., Heo, I., Demircan, T., Clevers, H. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell, 13(6), 653-658.
  7. Swaminathan, A, Heard K, Patel S, et al. Next-generation CRISPR therapies. Nat Biomed Eng. 2019;3(6): 496-499.
  8. Wang Y, Yu S, Huang S, et al. Chemically modified RNA-guided Cas9 nucleases retain genome-targeting capabilities. Nat Biotechnol. 2017;35(4): 288-290.
  9. Xu, X., et al. (2019). CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nature Protocols, 14.
  10. Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, Vegas AJ, Dorkin JR, Anderson DG. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-555.
  11. Yin, H., et al. (2016). Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics, 17(9), 541-555.
  12. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., & Anderson, D. G. (2014). Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics, 15(8), 541.

 

REFERENCES

  1. Huch M., Gehart, H., van Boxtel, R. (2015). Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell, 160(1-2) (In English).
  2. Kim J. (2016). Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Research, 26(12), 1339-1341 (In English).
  3. Li M, Li J, He X. CRISPR/Cas9-mediated genome editing using a chemically synthesized sgRNA delivery system. Chem Biol. 2015;22(1):807-817 (In English).
  4. Li Y., Li, J., Zhu, L. (2021). Advances in CRISPR/Cas-based gene therapy in human diseases. Theranostics, 11(7), 3226-3241 (In English).
  5. Liu Y., Lu, Y. (2020). Recent advances in genome editing using CRISPR/Cas9. Frontiers in genetics, 11, 605874 (In English).
  6. Schwank G., Koo, B.K., Sasselli, V. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell, 13(6), 653-658 (In English).
  7. Swaminathan A, Heard K, Patel S. Next-generation CRISPR therapies. Nat Biomed Eng. 2019;3(6): 496-499 (In English).
  8. Wang Y, Yu S, Huang S. Chemically modified RNA-guided Cas9 nucleases retain genome-targeting capabilities. Nat Biotechnol. 2017;35(4): 288-290 (In English).
  9. Xu X. (2019). CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nature Protocols, 14 (In English).
  10. Yin H. (2016). Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics, 17(9), 541-555 (In English).
  11. Yin H., Kanasty R.L., Eltoukhy A.A. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-555 (In English).
  12. Yin H., Kanasty, R.L., Eltoukhy, A.A. (2014). Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics, 15(8), 541 (In English).

 

Материал поступил в редакцию 27.03.23

 

 

INVESTIGATION OF THE EFFICIENCY OF NANOPARTICLE DELIVERY FOR PROTEIN GENOME EDITING IN INTESTINAL TISSUE: 3D MODELING AND MOLECULAR DYNAMICS

 

I.A. Ibragimova, Student of the Faculty of Medicine

Dagestan State Medical University

(367008, Russia, Makhachkala, V.I. Lenin Square, 1)

Email: ibragimova@gmail.com

 

K.O. Kerimov, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: hort@mail.ru

 

K.S. Kazimurzaeva, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: kazimurzaeva@yandex.ru

 

D.T. Tebloeva, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: Tebloeva256@gmail.com

 

V.G. Kelekhsaeva, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: kaz@yandex.ru

 

V.G. Kelekhsaeva, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: kaz25@yandex.ru

 

A.R. Umakhanova, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: Umahaeva45@yandex.ru

 

Z.R. Plieva, Student of the Pediatric Faculty

North Ossetian State Medical Academy (NOSMA)

(362025, Russia, Vladikavkaz, st. Pushkinskaya, 40)

Email: plievazarina@mail.ru

 

Abstract. Genome editing is a rapidly developing field that aims to edit DNA sequences for the treatment of genetic disorders, cancer and other diseases. However, the delivery of editing agents to target cells and tissues remains a challenging task. Nanoparticles have become a promising tool for the efficient delivery of biomolecules, including proteins. In the article we present a study of protein delivery using nanoparticles for genome editing in intestinal tissue using a 3D model. Using nanoparticles to deliver protein is a promising approach for genome editing in intestinal tissue. A 3D model of intestinal tissue provides an in vivo-like environment for studying protein delivery using nanoparticles.

Keywords: nanoparticles, protein genome, molecular dynamics.