ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА «ФОРСАЛЬ» ПРИ ВНУТРИМЫШЕЧНОМ ВВЕДЕНИИ ЖИВОТНЫМ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

УДК 615.012.6

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА «ФОРСАЛЬ»

ПРИ ВНУТРИМЫШЕЧНОМ ВВЕДЕНИИ ЖИВОТНЫМ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

 

А.И. Семыкина, аспирант

«Медицинский университет Реавиз»

(443001, Россия, Самара, ул., Чапаевская, 227)

Email: alenas93@mail.ru

 

Аннотация. Введение. В настоящее время правительство РФ обозначило основные направления развития фармацевтической промышленности, основной задачей которой является разработка современных инновационных технологий по производству отечественных высокоэффективных и конкурентоспособных лекарственных препаратов. Созданные новые лекарственные препараты обязательно должны пройти доклинические испытания. Цель исследования – исследование безопасности и противоопухолевого эффекта препарата «Форсоль» на живых объектах на доклиническом этапе in vivo. Материалы и методы: Исследования проведены в виварии ИЭМБ СамГМУ. Изучение острой токсичности на животных проводили на 30 белых половозрелых лабораторных крысах Wistar обоего пола массой 484±9 г (самцы) и 295±7 г (самки). Животные были разделены на 3 группы – контрольная и 2 экспериментальные, по 5 самцов и 5 самок в каждой группе. После декапитации собирали кровь для проведения общего и биохимического анализа. В сыворотке крови определяли содержание общего белка, глюкозы, триглицеридов, креатинина, мочевины, активность АЛАТ, АСАТ, ЛДГ, щелочной фосфатазы. При проведении морфологических и гистологических исследований  проводили осмотр  и исследование органов грудной и брюшной полостей на предмет анатомических изменений строение внутренних органов. Результаты. Анализ результатов изучения острой токсичности на крысах при однократном введении препарата показал отсутствие фактов гибели животных, изменений в общем состоянии, их двигательной активности, аппетита, состояния слизистых, кожных покровов и шерсти. Не выявлено достоверных изменений в массе тела до и после проведения эксперимента как у самцов, так и у самок. В группе крыс, которым вводили терапевтическую дозу препарата, отсутствуют достоверные изменения показателей общего анализа крови. У самок в сыворотке крови на 13 % достоверно повышается активность щелочной фосфатазы, остальные показатели в данной группе не отличаются от контрольных значений. В группе животных, которым вводили пятикратную терапевтическую дозу, наблюдается повышение содержания гемоглобина на 18 % в крови и общего белка на 16 % в сыворотке у самцов, увеличивается активность лактатдегидрогеназы на 46 % и щелочной фосфатазы на 27 % у самок. Заключение. Внутримышечное введение препарата в терапевтической дозе не оказывает токсического действия на организм экспериментальных животных. Умеренные изменения на препаратах почек животных, которым вводили пятикратную дозу препарата, более характерны для возрастных особенностей и могут являться спонтанными, не имеющими токсикологического значения. Таким образом, препарат «Форсоль» при внутримышечном введении в остром эксперименте не влияет на функции и морфологическое состояние основных органов и систем организма. Исходя из полученных результатов, дальнейшие исследования могут быть направлены на выявление эффектов препарата при комбинированном воздействии – внутримышечных инъекциях и непосредственном воздействии на опухолевые клетки путем локального введения в привитую опухоль.

Ключевые слова: токсичность, производство препаратов, эффективность, культура клеток органов.

 

Введение. В настоящее время правительство РФ обозначило основные направления развития фармацевтической промышленности, основной задачей которой является разработка современных инновационных технологий по производству отечественных высокоэффективных и конкурентоспособных лекарственных препаратов [6, 8]. Созданные новые лекарственные препараты обязательно должны пройти доклинические испытания [2, 4].

Между тем, к настоящему моменту имеется достаточное количество хорошо стандартизированных методов, в частности, с использованием культур клеток разной органной природы, позволяющих получать адекватную информацию для оценки влияния новых лекарственных препаратов на морфофункциональные состояния клеток [5, 7]. Проводимые исследования in vivo могут помочь раскрыть механизм действия новых лекарственных препаратов (противоопухолевый, цитотоксический и/или цитостатический эффект). Онкологические заболевания (представляют собой обширный и разнородный класс заболеваний) являются сложнейшей медико-социальной проблемой современного общества [3]. Такого рода болезни являются системными, так как затрагивают все органы и системы человеческого организма [1, 2]. В организме здорового человека постоянно происходят процессы деления клеток. Эти процессы происходят на протяжении всей жизни человека, причем имеется регулирующий механизм, управляющий клеточным размножением и соответственно ростом тканей. Под воздействием различных причин, состояние равновесия в организме человека может быть нарушено [3, 11].

Цель исследования – исследование безопасности и противоопухолевого эффекта препарата «Форсоль» на живых объектах на доклиническом этапе in vivo.

Задачи исследования:

1. Изучить острую токсичность лекарственного препарата на животных.

Исследование проведено по контролем Службы по обеспечению качества при проведении доклинических исследований лекарственных средств, состав утвержден Приказом Ректора СамГМУ № 35-н от 18.06.2020 г «Об организации Службы по обеспечению качества при проведении неклинических (доклинических) исследований в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики (GLP)».

Объект исследования и дизайн эксперимента

Исследования проведены в виварии ИЭМБ СамГМУ. Изучение острой токсичности на животных проводили на 30 белых половозрелых лабораторных крысах Wistar обоего пола массой 484±9 г (самцы) и 295±7 г (самки). Животные были разделены на 3 группы – контрольная и 2 экспериментальные, по 5 самцов и 5 самок в каждой группе. Крысам первой экспериментальной группы (Т) в бедренную мышцу с помощью стерильного шприца вводили терапевтическую дозу лекарственного препарата в объеме 0,3 мл (самцам) и 0,2 мл (самкам), учитывая массу животных разного пола и коэффициент межвидового перерасчета доз для животных и человека [9]. Расчет количества препарата проводили исходя из данных, что предполагаемый объем терапевтической дозы для человека составляет 1 мл/10 кг. Животным второй экспериментальной группы (Тх5) вводили аналогичные объемы препарата в дозе, пятикратно превышающую терапевтическую. Контрольную группу составили животные, которым внутримышечно вводили эквивалентные объемы стерильного физиологического раствора.

Животных содержали в условиях сертифицированного вивария при свободном доступе к пище и воде. При выполнении всех экспериментальных работ руководствовались национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434-2009

«Принципы надлежащей лабораторной практики», полностью аутентичного принципам GLP/OECD.

Срок наблюдения составил 10 сут, после чего животных взвешивали и выводили из эксперимента декапитацией. За сутки до вывода из эксперимента животных лишали доступа к пище.

Материалы и методы исследования

После декапитации собирали кровь для проведения общего (цельная кровь в микропробирку с ЭДТА) и биохимического анализа (пробирка с разделительным гелем для получения сыворотки крови). Общий анализ крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе «Mindray BC-5300», Китай. В сыворотке крови определяли содержание общего белка, глюкозы, триглицеридов, креатинина, мочевины, активность АЛАТ, АСАТ, ЛДГ, щелочной фосфатазы. Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом анализаторе «StatFax 3300», США.

Морфологические и гистологические исследования

После декапитации и вскрытия проводили осмотр органов грудной и брюшной полостей на предмет анатомических изменений строения внутренних органов. Извлекали и взвешивали сердце, головной мозг, печень, почку, селезенку, двенадцатиперстную кишку, надпочечник, матку и яичник у самок, семенник у самцов. Взвешивание органов проводили на аналитических весах «ВЛ-224В». Образцы материала фиксировали в 10 %-м забуференном формалине. Проводили макроскопический анализ материала, оценивали цвет, эластичность, консистенцию наличие внешних дефектов и патологических образований.

Далее вырезки фрагментов, подлежащих исследованию, закладывали в кассеты для гистологической проводки [8]. Процессинг (обезвоживание, обезжиривание, пропитка материала парафином) осуществляли с применением гистопроцессора карусельного типа Leica TP 1020. Изготавливали парафиновые блоки с применением станции заливки в парафин Leica EG 1150.

Изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм, с использованием ротационного микротома Leica RM 2125 STM. Срезы расправляли на водяной бане, наносили на предметное стекло.

Срезы депарафинизировали в растворе ксилола, окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные срезы заключали под покровное стекло. Полученные микропрепараты анализировали с помощью микроскопа Leica DM500, изготавливали микрофотографии с использованием цифрового USB микроскопа Levenhuk D870T.

1. 1. 1. . Статистическая обработка результатов исследований

Полученные данные подвергали статистической обработке в программах SigmaPlot 12.0 (Systat Software, США) и Excel 2010 (Microsoft corp., США) с использованием критерия нормальности распределения Шапиро-Уилка, F- критерия равенства выборок и t-критерия. Для определения равнозначности сравниваемых групп использовали метод Вилкоксона-Манна-Уитни. Результат выражали в виде средней арифметической, стандартного отклонения, ошибки средней арифметической. Статистически значимыми считали различия при вероятности ошибки первого рода менее 0,05 (p<0,05).

Результаты исследования.

Анализ результатов изучения острой токсичности при однократном введении препарата показал отсутствие фактов гибели животных, изменений в общем состоянии, их двигательной активности, аппетита, состояния слизистых, макроскопического строения жизненно важных органов, кожных покровов, и шерсти через 10 дней после введения препарата. Не выявлено достоверных изменений в массе тела (табл. 1) до и после проведения эксперимента как у самцов, так и у самок.

 

Таблица 1

Масса тела крыс до и после эксперимента, M±SEM

Группы   Показатель	Контроль		Т	Тх5
Масса тела до (числитель) и после (знаменатель) эксперимента, г	Самцы	493,6 ± 14,3 473,0 ± 13,5	498,2 ± 11,7 486,8 ± 10,6	461,0 ± 15,4 450,4 ± 14,8
	Самки	309,4 ± 15,9 286,0 ± 15,0	293,6 ± 6,1 273,4 ± 7,1	282,4 ± 15,2 258,2 ± 14,6

 

При анализе данных величин массовых коэффициентов внутренних органов самцов и самок установлено отсутствие разницы в средних величинах контрольной и опытных групп (табл. 2, 3). Макроскопическое исследование при вскрытии не выявило какой-либо патологии внутренних органов и тканей.

 

Таблица 2

Коэффициенты массы внутренних органов самцов крыс (в г на 100 г массы тела)

через 10 суток после введения препарата, M±SEM

Группы   Показатель	Контроль	Т	Тх5
1	2	3	4
Сердце	0,278±0,007	0,272±0,009	0,308±0,018
Мозг	0,375±0,009	0,386±0,011	0,410±0,015
Печень	3,326±0,147	3,444±0,174	3,528±0,135
Почка	0,403±0,009	0,419±0,040	0,416±0,018
Селезенка	0,253±0,012	0,244±0,018	0,238±0,010
12-ти перстная кишка	0,254±0,018	0,215±0,017	0,220±0,015
Надпочечник	0,0070±0,0008	0,0060±0,0004	0,0070±0,0007
Семенник	1,560±0,045	1,618±0,044	1,520±0,090

 

Таблица 3

Коэффициенты массы внутренних органов самок крыс (в г на 100 г массы тела)

через 10 суток после введения препарата, M±SEM

Группы   Показатель	Контроль	Т	Тх5
Сердце	0,420±0,035	0,399±0,041	0,382±0,017
Мозг	0,637±0,046	0,669±0,017	0,669±0,036
Печень	3,514±0,184	3,149±0,155	4,510±0,424
Почка	0,460±0,017	0,426±0,021	0,471±0,052
Селезенка	0,285±0,012	0,281±0,005	0,298±0,008
12-ти перстная кишка	0,298±0,032	0,250±0,027	0,340±0,044
Надпочечник	0,0145±0,0003	0,0143±0,0007	0,0145±0,0005
Матка	0,266±0,090	0,318±0,086	0,364±0,097
Яичник	0,029±0,008	0,032±0,001	0,035±0,003

 

По результатам общего анализа крови выявлено повышение уровня гемоглобина и гематокрита у самцов в группе животных, которым вводили пятикратно превышающую терапевтическую дозу препарата на 19 % и 17 % соответственно. Отмечена тенденция к снижению числа тромбоцитов у животных обоего пола в этой же группе, но эти изменения были статистически недостоверны (табл. 4).

 

 

 

 

 

Таблица 4

Показатели системы крови крыс после однократного введения терапевтической (Т)

и пятикратной (Тх5) доз препарата, М±SEM

Группы     Показатели		Контроль n=10		Т n=10		Тх5 n=9
		Самцы	Самки	Самцы	Самки	Самцы (4)	Самки (5)
Гемоглобин, г/л		129,4±5,7	134,0±5,1	134,0±5,1	139,8±3,2	153,3±5,5*	137,4±6,8
Эритроциты, ×1012		7,70±0,28	7,68±0,30	8,03±0,29	7,76±0,28	8,56±0,39	7,39±0,40
Лейкоциты, ×109		7,50±1,60	7,38±2,15	7,05±1,24	4,36±1,18	7,88±1,67	5,12±0,53
Тромбоциты, ×109		902,0±142,3	849,8±73,0	749,6±83,3	857,2±104,0	679,3±29,4	694,6±67,8
и н д е к с ы	HCT, %	43,0±1,62	43,1±1,8	43,4±1,77	44,1±1,1	50,2±2,42*	43,8±2,7
	MCV, фл	55,9±1,2	56,2±1,7	54,1±1,1	53,4±3,6	58,2±1,6	59,4±1,5
	MCH, пг	15,8±0,3	16,6±0,4	15,8±0,4	16,9±0,2	16,0±0,4	17,1±0,4
	MCHC, г/л	280,6±12,3	296,2±13,3	292,0±11,7	299,2±12,1	276,5±12,4	289,2±12,8
	PCT	0,57±0,09	0,54±0,05	0,50±0,05	0,55±0,06	0,44±0,05	0,43±0,05

* - отличие от показателя соответствующей контрольной группы статистически достоверно (p<0,05).

 

При анализе лейкоцитарного состава крови (табл. 5) отмечена тенденция к снижению числа сегментоядерных лейкоцитов и увеличению числа лимфоцитов в группе Тх5, но эти изменения носили недостоверный характер. Количество эозинофилов и палочкоядерных лейкоцитов составило во всех группах 1-2 %, скорость оседания эритроцитов 1-2, поэтому эти данные в таблице не приводятся.

 

Таблица 5

Лейкоцитарный состав крови крыс после однократного введения терапевтической (Т) и пятикратной (Тх5) доз препарата, результат представлен в виде среднего знач. ± ошибка среднего (М±SEM)

Группы	Контроль n=10		Т n=10		Тх5 n=9
Показатели	Самцы	Самки	Самцы	самки	Самцы (4)	Самки (5)
Лимфоциты, %	44,8±12,6	54,2±12,1	49,2±13,6	57,8±12,4	78,5±3,4	78,0±5,3
Сегментоядерн ые лейкоциты, %	20,6±3,2	24,2±6,5	21,0±4,5	25,8±7,9	12,8±4,8	17,2±5,6
Моноциты, %	3,60±1,66	3,00±1,55	2,8±0,34	1,60±0,40	5,25±2,29	2,80±0,74

 

Результаты биохимических исследований сыворотки крови представлены в таблице 6.

 

Таблица 6

Биохимические показатели сыворотки крови крыс, М±SEM

Группы   Показатели	Контроль, n=10		Т, n=10		Тх5, n=10
	Самцы	Самки	Самцы	Самки	Самцы	Самки
1	2	3	4	5	6	7
Общий белок, г/л	69,4±1,0	84,3±4,1#	76,2±4,0	85,0±1,2	80,7±4,00*	82,6±3,1
Глюкоза, ммоль/л	4,00±0,40	4,10±0,91	4,60±0,32	4,60±0,32	4,67±0,50	4,74±0,23
Триглицериды, ммоль/л	1,39±0,29	1,38±0,39	0,79±0,14	1,36±0,26	1,66±0,42	1,52±0,27
Креатинин, мкмоль/л	72,7±10,3	65,3±7,5	68,0±2,8	79,8±6,1	66,1±5,5	63,8±7,9
Мочевина, ммоль/л	5,67±0,64	4,59±0,49	4,89±0,54	6,27±0,74	4,67±0,49	5,45±0,46
АЛАТ, Ед/л	119,8±22,6	120,0±25,8	132,1±39,7	141,1±35,1	167,6±25,5	145,0±30,4
АСАТ, Ед/л	156,6±43,5	130,0±31,9	141,4± 29,1	130,7±28,8	144,7±28,8	161,9±32,1
ЛДГ, Ед/л	1222,8±97,4	1004,4±161,0	1074,1±246,3	1371,2±54,5	1003,0±254,0	1468,4±119,9*
ЩФ, Ед/л	166,6±18,4	182,8±3,1	185,9±16,3	206,8±8,8*	188,3±21,3	231,0±28,7*

*- отличие от соответствующей контрольной группы статистически достоверно (p<0,05)

^# - отличие показателя у самок от показателя у самцов аналогичной группы статистически достоверно (p<0,05)

 

Уровень общего белка у самцов в группе Тх5 достоверно повысился на 16 %. Самые высокие значения ЛДГ у самок в группе Tх5 достоверно отличаются от контроля на 46 %. Отмечено повышение активности ЩФ у самок двух экспериментальных групп (Т и Тх5) на 13 % и 26 % соответственно. Содержание общего белка в сыворотке самок контрольной группы крыс на 22 % выше, чем у самцов. Другие показатели существенно не отличались от значений контрольной группы.

У животных из каждой группы после вскрытия извлекали фрагмент мышечной ткани в месте введения препарата, сердце, печень, почки, надпочечник, селезенку, головной мозг, двенадцатиперстную кишку, лимфатический узел, по половому признаку - яичник, матку или семенник.

В области инъекции препарата как в опытных, так и в контрольной группе скелетная мышечная ткань через 10 сут сохраняет свою гистологическую структуру (рис. 25). Сохранены ее волокнистое строение и исчерченность, ядра миоцитов имеют уплощенную вытянутую форму, расположены на периферии клеток, мышечные волокна имеют полигональную форму (рис. 1 – в). Воспалительных проявлений и разрастания эндомизия не наблюдается, отек отсутствует.

 

а)  б)

в)

 

Рис. 1. Скелетная мышечная ткань крысы в месте введения препарата:

а – контроль, б - терапевтическая доза, в – пятикратная доза

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х400

 

При введении терапевтической дозы исследуемого вещества в месте инъекции структура скелетной мышечной ткани сохранена, на отдельных препаратах отмечена очаговая лимфоплазмоцитарная инфильтрация (рис. 2). Инъекции пятикратной дозы вызывали умеренный очаговый фиброз с рассеянной и очаговой полиморфноклеточной инфильтрацией (рис. 3).

 

 

Рис. 2. Скелетная мышечная ткань крысы в месте введения терапевтической дозы препарата.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х400

 

Рис. 3. Скелетная мышечная ткань крысы в месте введения пятикратной дозы препарата.

 Окрашивание гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

На препаратах печени сохранено балочно-дольковое строение, структура полигональных гепатоцитов с оксифильной зернистой цитоплазмой не нарушена, незначительное полнокровие центральных вен и капилляров в области портальных трактов (рис. 4 – а,б), незначительная дискомплексация балок в области центральных вен, в просвете синусоидов единичные макрофаги и лимфоциты (рисунок 4,в). В целом морфологическая структура органа свидетельствует об отсутствии симптомокомплекса гепатотоксичности, воспалительной реакции и интоксикации организма после внутримышечного введения исследуемого препарата.

 

а)  б)

в)

 

Рис. 4. Печень крысы: а – контроль, б – терапевтическая доза, в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

При гистологическом исследовании миокарда во всех группах обнаружено, что его волокнистое строение не нарушено, поперечная исчерченность сохранена, полнокровие сосудов в строме (рис. 5). Ядра кардиомиоцитов хорошо видны. В группе животных, которым вводили пятикратную дозу препарата в отдельных полях зрения отмечены: слабо выраженный очаговый интерстициальный отек, очаговая фрагментация мышечных волокон, очаги умеренной белковой дистрофии кардиомиоцитов. мелкоочаговый периваскулярный склероз со слабо выраженной лимфогистиоцитарной инфильтрацией. Эндокард представлен волокнистой соединительной тканью, выстланной уплощенным эндотелием. В перикарде и строме миокарда скопления тучных клеток (мастоцитов), отдельных с частично дегранулированной цитоплазмой.

а)  б)

в)

 

Рис. 5. Сердце крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

На препаратах почек как контрольной, так и двух опытных групп отмечались возрастные изменения, характерные для данного периода онтогенетического развития животных в виде очагового нефросклероза и атрофии канальцев, компенсаторного расширения сохранных канальцев, скопления в них эозинофильной жидкости (рис. 6). Клубочки распределены несколько неравномерно, различных размеров, в части клубочков отмечается пролиферация мезангия с формированием синехий между капиллярами и капсулой, полнокровие капилляров.

 

а) б)

в)

 

Рис. 6. Почка крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

Капсула селезенки у всех исследуемых животных не утолщена, наблюдается умеренное диффузное полнокровие красной пульпы, очаговые скопления гемосидерофагов и зерен внеклеточного буро-коричневого пигмента гемосидерина, полнокровие синусоидов. Лимфоидные фолликулы различных размеров (часть с умеренной краевой делимфатизацией, часть умеренно увеличены в размерах, сливаются между собой). Герминативные центры в большинстве фолликулов отсутствуют. Стенки центральных артерий лимфоидных фолликулов утолщены за счет склероза и гиалиноза, с сужением и облитерацией просвета отдельных сосудов (рис. 7).

а) б)

в)

 

Рис. 7. Селезенка крысы а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

 Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

При исследовании лимфоузлов выявлены общие особенности строения во всех группах: тонкая соединительнотканная капсула, увеличение количества тучных клеток (мастоцитов) в синусах узла и перинодулярной жировой ткани, неспецифическая лимфофолликулярная гиперплазия. Введение пятикратной дозы препарата способствовало расширению синусов и частичной дегрануляции отдельных клеток (рис. 8).

 

а)  б)

в)

 

Рис. 8. Лимфоузел крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

При исследовании гистологических препаратов головного мозга установлено, что гистоархитектоника структуры головного мозга не изменена (рис. 9). Отмечены сходные изменения для всех групп животных. Мягкая мозговая оболочка со слабо выраженным отеком, расширенными полнокровными сосудами. В ткани головного мозга и мозжечка неравномерный периваскулярный и перицеллюлярный отек, варьирующий от слабого до умеренного. В веществе мозга – неравномерное кровенаполнение сосудов (сосуды слабого, умеренного кровенаполнения, умеренно полнокровны). Очаговые дистрофические изменения нейронов, с признаками нейроцитолизиса, наличием «тающих» клеток и «клеток-теней». Умеренное полнокровие сосудистых сплетений (рис. 9 – б). Вероятнее всего, указанные изменения связаны со способом вывода животных из эксперимента и не связаны с воздействием исследуемого препарата на организм.

 

 

 

а)   б) 

в)

 

Рис. 9. Головной мозг крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

Ткань надпочечников обычного строения, с сохраненной гистиоархитектоникой (рис. 10). Структура слоев надпочечников в целом сохранена. Хорошо различима соединительнотканная капсула, клубочковая, пучковая и сетчатая зоны коркового вещества и более темное мозговое вещество. На отдельных препаратах контрольных крыс слабо выраженный интерстициальный отек, неравномерное кровенаполнение, слабо выраженная очаговая делипоидизация адренокортикоцитов коркового слоя.

 

а)  б)

в)

 

Рис. 10. Надпочечник крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

 Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

Значимых структурных изменений двенадцатиперстной кишки не выявлено (рис. 11). Cлизистая оболочка обычного строения (с наличием пальцевидных ворсин, четко различимой щеточной каемкой энтероцитов; в собственной пластинке равномерно скомпонованные крипты, скопления бруннеровых желез; плотность лимфоплазмоцитарного инфильтрата собственной пластинки низкая, в собственной пластинке и подслизистой основе единичные лимфоидные агрегаты и лимфоидные фолликулы), с небольшими участками десквамации покровного эпителия. Стенки двенадцатиперстной кишки со слабо выраженным интерстициальным отеком, неравномерным кровенаполнением.

а) б)

в)

 

Рис. 11. Двенадцатиперстная кишка крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

В яичниках всех групп животных корковое вещество представлено многочисленными фолликулами разной степени зрелости, обнаружены схожие изменения в виде небольших фиброзных изменений яичника. Определяются примордиальные и растущие фолликулы. Неравномерное кровенаполнение с преобладанием участков венозно-капиллярного полнокровия (рис. 12).

 

а)  б)

в)

 

Рис. 12. Яичник крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

Тело матки представлено эндометрием, миометрием и периметрием. Эндометрий покрыт однослойным призматическим эпителием, функциональный слой представлен компактной стромой и неравномерно распределенными прямыми трубчатыми железами, выстланными однослойным призматическим эпителием. Миометрий представлен пучками гладкомышечных волокон с эксцентрично расположенными мономорфными вытянутыми ядрами (рис. 13 – а, б). В строме эндометрия и в миометрии рассеянная и очаговая полиморфноклеточная инфильтрация с преобладанием эозинофильных лейкоцитов (рис. 13 – в).

а)  б)

в)

 

Рис. 13. Матка крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза, в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х400

 

Гистологическое строение семенников не нарушено, присутствуют признаки всех стадий сперматогенеза у самцов крыс всех исследуемых групп (рис. 14). Ткань яичка с сохранной гистиоархитектоникой, слабо выраженной стромой с наличием клеток Лейдига; паренхима представлена извитыми семенными канальцами, окруженными тонкой соединительнотканной оболочкой, эпителиальный компонент выполнен клетками Сертоли и сперматогенными элементами на всех стадиях сперматогенеза (сперматогонии, первичные и вторичные сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды).

 

а)  б)

в)

 

Рис. 14. Семенник крысы: а – контроль; б – терапевтическая доза; в – пятикратная доза.

Окрашивание: гематоксилин, эозин. Увеличение х100

 

После проведенного морфологического исследования органов в опытных группах существенных структурных изменений, связанных с внутримышечным введением препарата «Форсоль» не выявлено. Обнаруженные отклонения от нормы в печени, почках и сердце можно трактовать как возрастные.

Изменения в отдельных органах (неравномерное кровенаполнение сосудов, очаги делипоидизации коры надпочечников, десквамация покровного эпителия тонкой кишки) имеют признаки острых (стрессовых) реакций и, вероятно, являются следствием танатогенеза при выводе животного из эксперимента.

 

 

Заключение

Анализ результатов изучения острой токсичности на крысах при однократном введении препарата показал отсутствие фактов гибели животных, изменений в общем состоянии, их двигательной активности, аппетита, состояния слизистых, кожных покровов и шерсти. Не выявлено достоверных изменений в массе тела до и после проведения эксперимента как у самцов, так и у самок. В группе крыс, которым вводили терапевтическую дозу препарата, отсутствуют достоверные изменения показателей общего анализа крови. У самок в сыворотке крови на 13 % достоверно повышается активность щелочной фосфатазы, остальные показатели в данной группе не отличаются от контрольных значений. В группе животных, которым вводили пятикратную терапевтическую дозу, наблюдается повышение содержания гемоглобина на 18 % в крови и общего белка на 16 % в сыворотке у самцов, увеличивается активность лактатдегидрогеназы на 46 % и щелочной фосфатазы на 27 % у самок.

Внутримышечное введение препарата в терапевтической дозе не оказывает токсического действия на организм экспериментальных животных. Умеренные изменения на препаратах почек животных, которым вводили пятикратную дозу препарата, более характерны для возрастных особенностей и могут являться спонтанными [10, 11], не имеющими токсикологического значения. Таким образом, препарат «Форсоль» при внутримышечном введении в остром эксперименте не влияет на функции и морфологическое состояние основных органов и систем организма. Исходя из полученных результатов, дальнейшие исследования могут быть направлены на выявление эффектов препарата при комбинированном воздействии – внутримышечных инъекциях и непосредственном воздействии на опухолевые клетки путем локального введения в привитую опухоль.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бозо, И.Я., Деев, Р.В., Пинаев, Г.П. Фибробласт – специализированная клетка или функциональное состояние клеток мезенхимального происхождения? // Цитология. – 2010. – Т. 52. – № 2. – С. 99-109.
2. Еропкин, М.Ю., Еропкина, Е.М. Показатели клеточного метаболизма in vitro в исследовании антивирусных и антимикробных препаратов и скрининге цитопротекторных соединений. Режим доступа: https://www.influenza.spb.ru/files/File/pokkletmet.pdf 
3. Здоровье нации- здоровье среды // Здоровье населения и здоровье среды: pro et contra. [Коллектив авторов] / Под ред. чл.-корр. РАН Г.С. Розенберга, к.б.н. Р.С. Кузнецовой, д.б.н. Н.В. Костиной, д.м.н. Н.В. Лазаревой. Тольятти: Анна, 2021. – 374 с. https://elibrary.ru/item.asp?id=47985796
4. Кулмагамбетов, И.Р., Улмагамбетов, М.Р., Рысулы, М.Р., Дуйсенбаева, А.Ж. Новые направления тестирования лекарственных средств с использованием плюрипотентных стволовых клеток //Вестник КазНМУ. – 2015. – № 1. – С. 354-358.
5. Нефедова, И.Ф., Россинская, В.В., Волова, Л.Т., Болтовская, В.В, Кулагина, Л.Н. Использование возможностей интерференционной микроскопии для изучения культуры адгезивных клеток // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5. Режим доступа: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26800
6. Об утверждении Правил предоставления субсидий из федерального бюджета российским организациям на финансовое обеспечение части затрат на реализацию проектов по разработке современных технологий, организации производства и реализации на их основе конкурентоспособных лекарственных препаратов и о признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации / Постановление Правительства РФ № 1464 от 16.11.2019 г.
7. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
8. Brookes C., BowkerM., Wells P. P. Catalysts for the Selective Oxidation of Methanol / // Catalysts. – 2016. – Pp. 1-3.
9. Clothier R., Starzec G., Pradel L. et al. The prediction of human skin responses by using the combined in vitro fluorescein leakage/ Alamar blue (resazurin) assay // ATLA. – 2002. – Vol. 30. – Pp. 493-504.
10. Costa S. Madureira J., Valdiglesias V., Teixeira-Gomes A., Guedes de Pinho P. et al. Occupational exposure to formaldehyde and early biomarkers of cancer risk, immunotoxicity and susceptibility // Environ. Res. – 2019. – Vol. 179. – No. 3. – Pp. 10-29.
11.  Rozenberg G., Lazareva N., Simonov Y. et al. Integration of the Problem of Medical Ecology on the Level of the Highly Urbanized Region  / International journal of environmental & science education 2016, vol. 11, no. 15, 7668-7683   https://elibrary.ru/item.asp?id=27571525

 

REFERENCES

1.  Bozo I.YA., Deev R.V., Pinaev G.P. Fibroblast – specializirovannaya kletka ili funkcional'noe sostoyanie kletok mezenhimal'nogo proiskhozhdeniya? [Is fibroblast a specialized cell or a functional state of cells of mesenchymal origin?]. Citologiya [Cytology]. 2010. Vol. 52. No. 2. Pp. 99-109.

2.  Eropkin M.YU., Eropkina E.M. Pokazateli kletochnogo metabolizma in vitro v issledovanii antivirusnyh i antimikrobnyh preparatov i skrininge citoprotektornyh soedinenij [In vitro cellular metabolism indices in antiviral and antimicrobial drug research and cytoprotective compound screening]. Rezhim dostupa: https://www.influenza.spb.ru/files/File/pokkletmet.pdf 

3.  Zdorov'e nacii – zdorov'e sredy [Health of the nation – health of the environment]. Zdorov'e naseleniya i zdorov'e sredy: pro et contra [Public health and environmental health: pro et contra]. [Kollektiv avtorov] / Pod red. chl.-korr. RAN G.S. Rozenberga, k.b.n. R.S. Kuznecovoj, d.b.n. N.V. Kostinoj, d.m.n. N.V. Lazarevoj. Tol'yatti: Anna, 2021. 374 p. https://elibrary.ru/item.asp?id=47985796

4.  Kulmagambetov I.R., Ulmagambetov M.R., Rysuly M.R., Dujsenbaeva A.ZH. Novye napravleniya testirovaniya lekarstvennyh sredstv s ispol'zovaniem plyuripotentnyh stvolovyh kletok [New drug testing directions using pluripotent stem cells]. Vestnik KazNMU. 2015. No. 1. Pp. 354-358.

5.  Nefedova I.F., Rossinskaya V.V., Volova L.T., Boltovskaya V.V, Kulagina L.N. Ispol'zovanie vozmozhnostej interferencionnoj mikroskopii dlya izucheniya kul'tury adgezivnyh kletok [Harnessing Interference Microscopy Capabilities to Study Adhesive Cell Culture]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Modern problems of science and education]. 2017. No. 5. Rezhim dostupa: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26800

6.  Ob utverzhdenii Pravil predostavleniya subsidij iz federal'nogo byudzheta rossijskim organizaciyam na finansovoe obespechenie chasti zatrat na realizaciyu proektov po razrabotke sovremennyh tekhnologij, organizacii proizvodstva i realizacii na ih osnove konkurentosposobnyh lekarstvennyh preparatov i o priznanii utrativshimi silu nekotoryh aktov Pravitel'stva Rossijskoj Federacii [On approval of the Rules for the provision of subsidies from the federal budget to Russian organizations for the financial provision of part of the costs of implementing projects for the development of modern technologies, organization of production and sale of competitive medicines based on them and on the recognition as invalid of certain acts of the Government of the Russian Federation]. Postanovlenie Pravitel'stva RF № 1464 ot 16.11.2019 [Resolution of the Government of the Russian Federation No. 1464 from November 16, 2019].

7.  Prikaz Ministerstva zdravoohraneniya RF ot 1 aprelya 2016 g. № 199n «Ob utverzhdenii Pravil nadlezhashchej laboratornoj praktiki» [Order of the Ministry of Health of the Russian Federation of April 1, 2016 No. 199n “On approval of the Rules of Good Laboratory Practice].

8.  Brookes C., BowkerM., Wells P. P. Catalysts for the Selective Oxidation of Methanol. Catalysts. 2016. Pp. 1-3.

9.  Clothier R., Starzec G., Pradel L. et al. The prediction of human skin responses by using the combined in vitro fluorescein leakage. Alamar blue (resazurin) assay. ATLA. 2002. Vol. 30. Pp. 493-504.

10. Costa S. Madureira J., Valdiglesias V., Teixeira-Gomes A., Guedes de Pinho P. et al. Occupational exposure to formaldehyde and early biomarkers of cancer risk, immunotoxicity and susceptibility. Environ. Res. 2019. Vol. 179. No. 3. Pp. 10-29.

11. Rozenberg G., Lazareva N., Simonov Y. et al. Integration of the Problem of Medical Ecology on the Level of the Highly Urbanized Region. International journal of environmental & science education 2016, vol. 11, no. 15, 7668-7683   https://elibrary.ru/item.asp?id=27571525

 

Материал поступил в редакцию 19.01.24

 

 

DETERMINATION OF ACUTE TOXICITY OF THE DRUG "FORSAL" WHEN INTRAMUSCULAR ADMINISTRATION TO ANIMALS (EXPERIMENTAL STUDIES)

 

A.I. Semykina, Graduate Student

Reaviz Medical University

(443001, Russia, Samara, st., Chapaevskaya, 227)

Email: alenas93@mail.ru

 

Abstract. Introduction. Currently, the government of the Russian Federation has outlined the main directions for the development of the pharmaceutical industry, the main task of which is the development of modern innovative technologies for the production of domestic, highly effective and competitive drugs. New drugs created must undergo preclinical testing. The purpose of the study is to study the safety and antitumor effect of the drug “Forsol” on living objects at the preclinical stage in vivo. Materials and methods: The studies were carried out in the vivarium of the Samara State Medical University. Acute toxicity studies in animals were carried out on 30 white mature Wistar laboratory rats of both sexes weighing 484±9 g (males) and 295±7 g (females). The animals were divided into 3 groups – control and 2 experimental, 5 males and 5 females in each group. After decapitation, blood was collected for general and biochemical analysis. The content of total protein, glucose, triglycerides, creatinine, urea, the activity of ALAT, ASAT, LDH, and alkaline phosphatase were determined in the blood serum. When conducting morphological and histological studies, the organs of the thoracic and abdominal cavities were examined and examined for anatomical changes in the structure of internal organs. Results. Analysis of the results of studying acute toxicity in rats with a single administration of the drug showed the absence of deaths of animals, changes in the general condition, their motor activity, appetite, condition of mucous membranes, skin and fur. There were no significant changes in body weight before and after the experiment in both males and females.In the group of rats that were administered a therapeutic dose of the drug, there were no significant changes in the parameters of the general blood test. In females, the activity of alkaline phosphatase in the blood serum significantly increases by 13%; other indicators in this group do not differ from the control values. In the group of animals that were administered a five-fold therapeutic dose, there was an increase in hemoglobin content by 18% in the blood and total protein by 16% in the serum in males, and the activity of lactate dehydrogenase increased by 46% and alkaline phosphatase by 27% in females. Conclusion. Intramuscular administration of the drug in a therapeutic dose does not have a toxic effect on the body of experimental animals. Moderate changes in kidney preparations of animals that were administered a five-fold dose of the drug are more typical of age-related characteristics and may be spontaneous,, without toxicological significance. Thus, the drug “Forsol” when administered intramuscularly in an acute experiment does not affect the functions and morphological state of the main organs and systems of the body. Based on the results obtained, further studies can be aimed at identifying the effects of the drug with combined effects – intramuscular injections and direct effects on tumor cells through local administration into the grafted tumor.

Keywords: toxicity, drug production, effectiveness, organ cell culture.